5-Methylcytosin je organická sloučenina, methylovaná forma nukleové bázecytosinu, sloužící jako regulátor transkripce genů, i v několika dalších biologických dějích.[2] Při methylování cytosinu se posloupnost DNA (pořadí nukleových bází) nemění, ale může se měnit exprese takto upraveného genu. 5-Methylcytosin je součástí nukleosidu 5-methylcytidinu.
Objev
W. G. Ruppel v roce 1898 při pokusu o izolaci bakteriálního toxinu zodpovědného za tuberkulózu z Mycobacterium tuberculosis získal novou nukleovou kyselinu, kterou nazval kyselina tuberkulinová.[3] Ukázalo se, že tato látka má neobvyklou strukturu, protože kromě thyminu, guaninu, a cytosinu, obsahuje také methylovaný nukleotid. V roce 1925, bylo detekováno malé množství methylovaného cytosinu jako produktu hydrolýzy kyseliny tuberkulinové kyselinou sírovou.[4][5] Vydaný článek byl napadán, protože určení produktu bylo založeno pouze na optikých vlastnostech krystalického pikrátu, a výsledky se nepodařilo zopakovat;[6] v roce 1948 ale Rollin Douglas Hotchkiss potvrdil jeho existenci při separaci nukleových kyselin z telecího brzlíku pomocí papírové chromatografie, kde detekoval methylovaný cytosin, látku odlišnou od běžného cytosinu i uracilu.[7]
Později byl methylcytosin nalezen také v mnoha molekulách RNA, kde ale jeho účel není znám.[8]
V bakteriích se 5-methylcytosin vyskytuje na řadě míst, často chrání DNA před štěpením restrikčními endonukleázami.
U rostlin se objevuje v CpG, CpHpG a CpHpH (H = A, C nebo T).
U hub a živočichů je 5-methylcytosin přítomen převážně v dinukleotidech. Většina eukaryot methyluje pouze malou část těchto míst, ale u obratlovců je methylováno 70-80 % CpG cytosinů. V buňkách savců se skupiny CpG na 5'-koncích genů označují jako CpG ostrovy.[10] 1 % veškeré savčí DNA je tvořeno 5mC.[11]
Zatímco samovolnou deaminací cytosinu vzniká uracil, který je rizpoznáván a odstraňován enzymy opravujícími DNA, tak deaminace 5-methylcytosinu vytváří thymin, přičemž tato změna cytosinu (C) na thymin (T) může vyvolat tranziční mutaci.[12]
Aktivní enzymatická deaminace cytosinu nebo 5-methylcytosinu cytosindeaminázami ze skupiny APOBEC mohou být výhodné pro mnohé buněčné procesy a pro vývoj organismu.[13] Vliv deaminace na 5-hydroxymethylcytosin není prozkoumán takto podrobně.
V laboratořích
Deaminaci, odstranění skupiny NH2, 5-methylcytosinu na thymin lze provést například kyselinou dusitou; obdobně se provádí i deaminace cytosinu na uracil (U).
Deaminace 5-methylcytosinu na thymin
5-methylcytosin je odolný vůči deaminaci hydrogensiřičitany, které působí na nemethylovaný cytosin; této vlastnosti se využívá k analýze methylace cytosinu v DNA hydrogensiřičitanovým sekvencováním.[14]
Navazování a regulace pomocí DNMT u eukaryot
5mC se na genomovou DNA navazují působením DNA methyltransferáz (DNMT). U člověka se vyskytuje 5 druhů DNMT, DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B, a DNMT3L, řasy a houby mají další 3 (DNMT4, DNMT5, DNMT6).[15] DNMT1 obsahuje replikační sekvence RFTS a domény CXXC, které katalyzují napojování 5mC. RFTS navádí DNMT1 na místa replikace DNA za spolupůsobení 5mC na dceřiných vláknech DNA, zatímco CXXC obsahuje zinkový prst, zajišťující de novo methylaci DNA.[16] DNMT1 je nejrozšířenější DNA methyltransferázou ve všech lidských tkáních.[17]
De novo methylaci zprostředkovávají hlavně DNMT3A a DNMT3B, za udržování 5mC značek při replikaci je zodpovědná DNMT1.[2] DNMT mohou interagovat mezi sebou a tím navyšovat kapacitu methylace; například 2 DNMT3L mohou vytvořit komplex se dvěma DNMT3A, čímž se zlepší interakce s DNA, což urychlí methylaci.[18]
Změny exprese DNMT vyvolávají odchylky v průběhu methylace. Nadměrná exprese způsobuje zvýšenou míru methylace, zatímco narušení funkce enzymu ji snižuje.[17]
Navázání methylové skupiny na cytosin
Mechanismus methylace cytosinu začíná nukleofilním atakem cysteinového zbytku umístěného na PCQ motivu DNMT na uhlíku, který má být methylován. Následně S-adenosylmethionin poskytne methylovou skupinu a ta se naváže na uhlík v poloze 5. Zásaditá skupina v enzymu DNMT deprotonuje tento uhlík, čímž se odstraní přebývající atom vodíku a obnoví dvojná vazba mezi uhlíky 5 a 6, čímž vznikne 5-methylcytosin.[16]
Demethylace
Po methylaci cytosinu na 5mC může opačný proces proběhnout několika způsoby. Pasivní demethylace DNA demethylation probíhá průběžně během replikace v důsledku absence údržby zprostředkované DNMT. Při aktivní demethylatci proběhne posloupnost oxidačních reakcí, jejímiž výsledky jsou postupně 5-hydroxymethylcytosin (5hmC), 5-formylcytosin (5fC), a 5-karboxylcytosin (5caC), přičemž poslední dvě uvedené molekuly jsou sestřiženy působením thymin-DNA glykosylázy (TDG), po které následuje opravná reakce za vzniku cytosinu.[2] TDG vytváří dvojnásobný nárust množství 5fC, aniž by došlo ke statisticky postřehnutelným změnám koncentrace 5hmC, což naznačuje, že 5mC se průběžně oxiduje nejméně dvakrát než dojde k úplné demethylaci.[19]
Oxidaci zajišťují dioxygenázy ze skupiny TET, které mohou pořeměnit 5mC, 5hmC, a 5fC na odpovídající oxidované molekuly; nejvyšší afinitu má ale enzym k 5mC a počáteční rychlostní konstanta přeměny 5hmC a 5fC pomoicí TET2 je 4,9-7,6krát nižší.[20]
Nádorové buňky vyrábějí 2-hydroxyglutarát (2HG), který do těchto procesů vstupuje podobně jako α-KG, čímž kompetitivní inhibicí snižují aktivitu TET, a tak omezují přeměnu 5mC na 5hmC.[22]
Působení u lidí
V nádorových buňkách
V nádorových buňkách může být míra methylace DNA buď příliš vysoká (hypermethylace), nebo příliš nízká (hypomethylace).[23] CpG ostrůvky jsou de novo methylovány, což vede k nevhodné deaktivaci genů obvykle spojených s tlumením růstu nádorů.[24]
V nádorových tkáních jsou oproti zdravým vyšší koncentrace methyltransferáz DNMT1, DNMT3A, a především DNMT3B, přičemž se všechny podílejí na zvýšených hladinách 5mC.[17] Opakující se sekvence genomu jsou zde často hypomethylované, takže dochází k expresi jinak potlačovaných genů; intenzita této odchylky často odpovídá postupu nádoru.[23] Předpokládá se, že existuje spojení mezi hypermethylací a hypomethylací; nadměrná aktivita methyltransferáz vytvářející nadměrná množství de novo 5mC jsou vyrovnávána demethylacemi, odstranění methylových skupin je ale neúčinné, což vede k rozšíření hypomethylace po celém genomu; může nastat i opačný stav, kdy nadměrná exprese hypomethylace vyvolává hypermethylaci v rámci celého genomu.[23] Cisplatina reaguje s 5mC.[25]
↑E. Vischer; S. Zamenhof; E. Chargaff. Microbial nucleic acids: the desoxypentose nucleic acids of avian tubercle bacilli and yeast. Journal of Biological Chemistry. 1949, s. 429–438. DOI10.1016/S0021-9258(18)57100-3. PMID18107446.
↑R. D. Hotchkiss. The quantitative separation of purines, pyrimidines and nucleosides by paper chromatography. Journal of Biological Chemistry. 1948, s. 315–332. DOI10.1016/S0021-9258(18)57261-6. PMID18873306.
↑J. E. Squires, H. R. Patel, M. Nousch, T. Sibbritt, D. T. Humphreys, B. J. Parker, C. M. Suter, T. Preiss. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 2012, s. 5023–5033. DOI10.1093/nar/gks144. PMID22344696.
↑R. Chahwan; S. N. Wontakal; S. Roa. Crosstalk between genetic and epigenetic information through cytosine deamination. Trends in Genetics. 2010, s. 443–448. DOI10.1016/j.tig.2010.07.005. PMID20800313.
↑S. J. Clark; J. Harrison; C. L. Paul; M. Frommer. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Research. 1994, s. 2990–2997. DOI10.1093/nar/22.15.2990. PMID8065911.
↑ abcK. D. Robertson; E. Uzvolgyi; G. Liang; C. Talmadge; J. Sumegi; F. A. Gonzales; P. A. Jones. The human DNA methyltransferases (DNMTs) 1, 3a and 3b: coordinate mRNA expression in normal tissues and overexpression in tumors. Nucleic Acids Research. 1999, s. 2291–2298. ISSN0305-1048. DOI10.1093/nar/27.11.2291. PMID10325416.
↑Chun-Xiao Song, Keith E. Szulwach, Qing Dai, Ye Fu, Shi-Qing Mao, Li Lin, Craig Street, Yujing Li, Mickael Poidevin, Hao Wu, Juan Gao. Genome-wide profiling of 5-formylcytosine reveals its roles in epigenetic priming. Cell. 2013-04-25, s. 678–691. ISSN1097-4172. DOI10.1016/j.cell.2013.04.001. PMID23602153.
↑Shinsuke Ito, Li Shen, Qing Dai, Susan C. Wu, Leonard B. Collins, James A. Swenberg, Chuan He, Yi Zhang. Tet Proteins Can Convert 5-Methylcytosine to 5-Formylcytosine and 5-Carboxylcytosine. Science. 2011-09-02, s. 1300–1303. ISSN0036-8075. DOI21778364. Bibcode2011Sci...333.1300I.
↑Xingyu Lu; Boxuan Simen Zhao; Chuan He. TET Family Proteins: Oxidation Activity, Interacting Molecules, and Functions in Diseases. Chemical Reviews. 2015-02-12, s. 2225–2239. ISSN0009-2665. DOI10.1021/cr500470n. PMID25675246.
↑Wei Xu, Hui Yang, Ying Liu, Ying Yang, Ping Wang, Se-Hee Kim, Shinsuke Ito, Chen Yang, Pu Wang, Meng-Tao Xiao, Li-xia Liu. Oncometabolite 2-Hydroxyglutarate Is a Competitive Inhibitor of α-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases. Cancer Cell. 2011-01-18, s. 17–30. ISSN1535-6108. DOI10.1016/j.ccr.2010.12.014. PMID21251613.
↑Annika Menke; Romeo C. A. Dubini; Peter Mayer; Petra Rovó; Lena Daumann. Formation of Cisplatin Adducts with the Epigenetically-relevant Nucleobase 5-Methylcytosine. European Journal of Inorganic Chemistry. 2020-10-23, s. 30–36. ISSN1434-1948. DOI10.1002/ejic.202000898.
Anthony J. F. Griffiths. An Introduction to genetic analysis. San Francisco: W. H. Freeman, 1999. ISBN0-7167-3520-2. Kapitola Chapter 15: Gene Mutation.