Funktionsweise des PCR-Tests, erklärt am Beispiel eines Corona-Tests (Video)

Als Polymerase-Kettenreaktion (englisch polymerase chain reaction, PCR) bezeichnet man Methoden zur in vitro-Vervielfältigung von Erbsubstanz (Desoxyribonukleinsäure). Dazu werden, je nach Methode, verschiedene Formen des Enzyms DNA-Polymerase verwendet. Die Bezeichnung Kettenreaktion bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Produkte vorheriger Zyklen als Ausgangsstoffe für die nächsten Zyklen dienen und somit eine exponentielle Vervielfältigung ermöglichen.

Bei der klassischen PCR werden diese Zyklen über ein Temperaturprogramm gesteuert. Bei der Weiterentwicklung isotherme DNA-Amplifikation erfolgt diese Vervielfältigung kontinuierlich bei konstanter Temperatur.

Die PCR wird in biologischen und medizinischen Laboratorien zum Beispiel für die Erkennung von Erbkrankheiten und Virusinfektionen, für das Erstellen und Überprüfen genetischer Fingerabdrücke, für das Klonieren von Genen und für Abstammungsgutachten verwendet. Sie ist die empfindlichste und zuverlässigste Labor-Methode des direkten Erregernachweises.

Entwickelt wurde die Methode durch den Biochemiker Kary Mullis im Jahr 1985[1][2]. 1993 wurde ihm dafür der Nobelpreis für Chemie verliehen. Die PCR zählt heute zu den wichtigsten Methoden der modernen Molekularbiologie, und viele wissenschaftliche Fortschritte auf diesem Gebiet (z. B. im Rahmen des Humangenomprojekts) wären ohne diese Methode nicht möglich gewesen.

Geschichte

Thermocycler „Baby Blue“, ca. 1986
Thermocycler
Zwei Thermocycler mit einem gemeinsamen Bedienelement

Anfang der 1970er Jahre kam der norwegische Postdoc Kjell Kleppe im Labor von Nobelpreisträger Har Gobind Khorana auf den Gedanken, DNA durch zwei flankierende Primer zu vervielfältigen, jedoch geriet die Idee in Vergessenheit.[3] Die Polymerase-Kettenreaktion selbst wurde 1983 von Kary Mullis erneut erfunden. Seine Absicht war es, ein neuartiges DNA-Syntheseverfahren zu entwickeln, das DNA durch wiederholte Verdopplung in mehreren Zyklen mittels eines Enzyms namens DNA-Polymerase künstlich vervielfältigt. Sieben Jahre nach der Veröffentlichung seiner Idee wurde Mullis hierfür 1993 der Nobelpreis für Chemie verliehen.[4]

DNA-Polymerase kommt in allen Lebewesen vor und verdoppelt während der Replikation die DNA vor der Zellteilung. Dazu bindet sie sich an einen einzelnen DNA-Strang und synthetisiert mittels eines kurzen komplementären Oligonukleotids (Primer) einen dazu komplementären Strang. Bereits in Mullis’ ursprünglichem PCR-Versuch wurde das Enzym in vitro verwendet. Die doppelsträngige DNA wurde zunächst durch Erhitzen auf 96 °C in zwei Einzelstränge getrennt. Bei dieser Temperatur wurde die dabei zunächst verwendete DNA-Polymerase I von E. coli zerstört und musste daher nach jedem Erhitzen erneut zugegeben werden. Diese Folge von Arbeitsschritten musste mehrere dutzendmal in Folge wiederholt werden, um eine ausreichende Amplifikation zu erreichen. Mullis’ ursprüngliches Verfahren war daher sehr ineffizient, da es viel Zeit, große Mengen DNA-Polymerase und ständige Aufmerksamkeit erforderte.

Eine entscheidende Verbesserung der PCR-Technologie brachte die Verwendung von thermostabilen DNA-Polymerasen, das heißt von Enzymen, die auch bei Temperaturen von annähernd 100 °C ihre Polymerase-Aktivität behalten und nicht denaturieren. Eine der ersten thermostabilen DNA-Polymerasen wurde aus dem in heißen Quellen lebenden thermophilen Bakterium Thermus aquaticus gewonnen und Taq-Polymerase genannt. Durch die Verwendung thermostabiler DNA-Polymerasen bestand keine Notwendigkeit mehr, ständig neue Polymerase zuzugeben, und der ganze PCR-Prozess konnte erheblich vereinfacht und automatisiert werden.

Mullis arbeitete zu dieser Zeit für die kalifornische Biotech-Firma Cetus und wurde mit einer Prämie von 10.000 US-Dollar abgefunden. Diese meldete die PCR-Methode zum Patent an.[2] Jahre später verkaufte Cetus dann die Rechte an der PCR-Methode mitsamt dem Patent für die von ihm verwendete DNA-Polymerase Taq an die Firma Roche für 300 Millionen Dollar. Das Enzym Taq wurde jedoch bereits 1980 von dem russischen Forscher Kaledin beschrieben. Aus diesem Grund wurde nach jahrelangem Rechtsstreit der Firma Roche das Patent für Taq inzwischen entzogen. Die US-Patente für die PCR-Technologie selbst liefen im März 2005 aus.

Die Taq-Polymerase erfährt nach wie vor breite Anwendung. Ihr Nachteil liegt darin, dass sie manchmal Fehler beim Kopieren der DNA produziert, was zu Mutationen in der DNA-Sequenz führt. Polymerasen wie Pwo und Pfu, die aus Archaea gewonnen werden, haben einen Korrekturmechanismus, der die Anzahl der Mutationen in der kopierten DNA erheblich senkt.

Prinzip

PCR wird eingesetzt, um einen kurzen, genau definierten Teil eines DNA-Strangs zu vervielfältigen. Der zu vervielfältigende Bereich der DNA wird auch als Amplicon bezeichnet, die bei der PCR entstehenden Produkte als Amplifikate. Dabei kann es sich um ein Gen oder auch nur um einen Teil eines Gens handeln oder auch um nichtcodierende DNA-Sequenzen. Im Gegensatz zu lebenden Organismen kann der PCR-Prozess nur relativ kurze DNA-Abschnitte kopieren. Bei einer Standard-PCR können dies bis zu etwa dreitausend Basenpaare (3 kbp) lange DNA-Fragmente sein. Mit Hilfe bestimmter Polymerasen-Gemische, weiterer Additive in der PCR und optimalen Bedingungen können sogar Fragmente mit einer Länge von über 20–40 kbp vervielfältigt werden, was immer noch sehr viel kürzer ist als die chromosomale DNA einer eukaryotischen Zelle. Eine menschliche Zelle enthält beispielsweise etwa drei Milliarden Basenpaare pro haploidem Genom.[5]

Komponenten und Reagenzien

PCR-Reaktionsgefäße.
Geöffneter Thermocycler, Heizblock mit 8 PCR-Reaktionsgefäßen

Eine PCR benötigt mehrere grundlegende Komponenten. Diese sind:

Die Reaktion wird üblicherweise in Volumina von 10–200 µl in kleinen Reaktionsgefäßen (200–500 µl) in einem Thermocycler durchgeführt. Diese Maschine erhitzt und kühlt die in ihr befindlichen Reaktionsgefäße präzise auf die Temperatur, die für den jeweiligen Schritt benötigt wird. Etwaige Kondensatbildung im Deckel des Gefäßes wird durch einen beheizbaren Gerätedeckel (über 100 °C) verhindert. Die Thermocycler der ersten Generation besaßen noch keinen beheizten Deckel, weshalb bei diesen Geräten zur Vermeidung einer Verdampfung von Wasser während der PCR die Reaktionsansätze mit Mineralöl überschichtet wurden. Als Reaktionsgefäß können, je nach Probeneinsatz bzw. Heizblock des Thermocyclers, neben einzelnen 200-µl-Reaktionsgefäßen auch acht zusammenhängende 200-µl-Reaktionsgefäße oder PCR-Platten für bis zu 96 Ansätze mit 200 µl oder auch 384 Ansätze zu je 50 µl verwendet werden. Die Platten werden entweder mit einer Gummiabdeckung oder einer selbstklebenden Klarsichtfolie verschlossen.

Beispiel

Als allgemeines Beispiel sei hier eine typische Zusammensetzung einer PCR-Reaktion wiedergegeben. Viele Beispiele für die verschiedensten Variationen der PCR finden sich in der wissenschaftlichen Literatur in verschiedensten Kombinationen:

1,0 µl DNA-Lösung (100 ng/µl)
2,0 µl Primer (i. d. R. zwei, jeweils 1 µl) (10 pmol/µl)
4,0 µl 10 mmol Desoxy-Nukleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), je dNTP 1 µl
5,0 µl 10-fach konzentrierte Polymerase-Pufferlösung
37,0 µl H2O
1,0 µl Pfu-, Taq- oder andere thermostabile DNA-Polymerase (1–5 U/µl)

50,0 µl Gesamtvolumen

Ablauf

Der PCR-Prozess besteht aus etwa 20–50 Zyklen, die in einem Thermocycler durchgeführt werden. Die folgenden Angaben sind als Richtwerte gedacht. Meist muss eine PCR auf die spezifische Reaktion hin optimiert werden. Jeder Zyklus besteht aus drei Schritten (siehe Abbildung unterhalb):

  1. Denaturierung (Melting, Schmelzen): Zunächst wird die doppelsträngige DNA auf 94–96 °C erhitzt, um die Stränge zu trennen. Die Wasserstoffbrückenbindungen, die die beiden DNA-Stränge zusammenhalten, werden aufgebrochen. Im ersten Zyklus wird die DNA oft für längere Zeit erhitzt (Initialisierung), um sicherzustellen, dass sich sowohl die Ausgangs-DNA als auch die Primer vollständig voneinander getrennt haben und nur noch Einzelstränge vorliegen. Manche (sogenannte Hot-Start-) Polymerasen müssen durch eine noch längere anfängliche Erhitzungsphase (bis zu 15 Minuten) aktiviert werden.
  2. Primerhybridisierung (primer annealing): In diesem Schritt wird die Temperatur abgesenkt und ca. 30 Sekunden lang auf einem Wert gehalten, der eine spezifische Anlagerung der Primer an die DNA erlaubt. Die genaue Temperatur wird hierbei durch die Länge und die Sequenz der Primer bestimmt (bzw. der passenden Nukleotide im Primer, wenn durch diesen Mutationen eingeführt werden sollen = site-directed mutagenesis). Wird die Temperatur zu niedrig gewählt, können sich die Primer unter Umständen auch an nicht hundertprozentig komplementären Sequenzen anlagern und so zu unspezifischen Produkten („Geisterbanden“) führen. Wird die Temperatur zu hoch gewählt, ist die thermische Bewegung der Primer unter Umständen so groß, dass sie sich nicht richtig anheften können, so dass es zu gar keiner oder nur ineffizienter Produktbildung kommt. Die Temperatur, welche die beiden oben genannten Effekte weitgehend ausschließt, liegt normalerweise 5–10 °C unter dem Schmelzpunkt der Primersequenzen; dies entspricht meist einer Temperatur von 55 bis 65 °C.
  3. Elongation (Extension, Polymerisation, Verlängerung, Amplifikation): Schließlich füllt die DNA-Polymerase die fehlenden Stränge mit freien Nukleotiden auf. Sie beginnt am 3'-Ende des angelagerten Primers und folgt dann dem DNA-Strang. Der Primer wird nicht wieder abgelöst, er bildet den Anfang des neuen Einzelstrangs. Die Temperatur hängt vom Arbeitsoptimum der verwendeten DNA-Polymerase ab (68–72 °C). Bei diesen Temperaturen können jedoch nur ganz bestimmte Enzyme arbeiten. Oft wird hier die Taq-Polymerase genutzt. Dieser Schritt dauert etwa 30 Sekunden je 500 Basenpaare, variiert aber in Abhängigkeit von der verwendeten DNA-Polymerase. Die PCR-Produkte sind anschließend viele Tage auch bei Raumtemperatur stabil, sodass eine Weiterverarbeitung nicht sofort erfolgen muss. In vielen Laboren hat es sich etabliert, die Proben im Thermocycler nach Ende der PCR auf 4–8 °C herunter zu kühlen. Viele Hersteller raten davon jedoch ab, da aufgrund von Kondensation im Metallblock die Lebenszeit eines Cyclers mit Peltier-Element stark reduziert wird.[6]
PCR
Ablauf einer Polymerasen-Kettenreaktion

Dies ist der theoretische Idealfall, in der Praxis fallen aber zudem in geringem Maße auch kürzere Fragmente als die gewünschte Ziel-DNA an. Diese kurzen Fragmente häufen sich vor allem in den späten Zyklen an und können durch Fehlpaarung der Primer auch zu falschen PCR Produkten werden. Daher werden bei PCR Reaktionen meist nur etwa 30 Zyklen durchlaufen, damit vorwiegend DNA der gewünschten Länge und Sequenz produziert wird.

Aufreinigung von PCR-Produkten

Das PCR-Produkt in niedriger (Spur 2) und hoher (Spur 3) Konzentration im Vergleich mit der DNA-Leiter (Spur 1) in Agarose-Gel.

Ein PCR-Produkt kann durch Agarose-Gelelektrophorese anhand seiner Größe identifiziert werden. (Die Agarose-Gelelektrophorese ist ein Verfahren, bei der DNA in ein Agarose-Gel eingebracht wird und anschließend eine Spannung angelegt wird. Dann bewegen sich die kürzeren DNA-Stränge schneller als die längeren auf den Pluspol zu.) Die Länge des PCR-Produkts kann durch einen Vergleich mit einer DNA-Leiter, die DNA-Fragmente bekannter Größe enthält und parallel zur Probe im Gel mitläuft, bestimmt werden. Soll die PCR vor allem als quantitativer Nachweis dienen, empfiehlt sich die Real Time PCR oder die Digital PCR.

PCR-Optimierung

Verschiedene Methoden können eingesetzt werden, um die Synthesemengen zu steigern oder Inhibitoren der PCR zu beseitigen.

Varianten

Die klassische PCR ist durch zahlreiche Variationen erweitert und verbessert worden. Dadurch können verschiedene Aufgaben spezifisch angegangen werden. Alternativ zur PCR können auch verschiedene Methoden der isothermalen DNA-Amplifikation oder Ligase-Kettenreaktion verwendet werden.

Anwendungsgebiete

Die PCR kommt als Methode zur Detektion und Vervielfältigung von DNA-Abschnitten in einer Vielzahl von Anwendungsgebieten zum Einsatz.

Forschung

Medizin und Diagnostik

Forensik, Paläontologie und Biologische Anthropologie

Lebensmittelanalytik

Die steigenden Anforderungen von Handel und behördlicher Lebensmittelüberwachung zur Aufklärung und Verhinderung von unlauterem Wettbewerb führten zum Einzug der Technologie in die Lebensmittelanalytik.[16] So kann die PCR zur Identifizierung von Gewürzen in komplexen Lebensmittelmatrizes herangezogen werden.[17] Sie kann auch zur Unterscheidung von Varietäten bei Edelkakao z. B. Criollo und Forastero eingesetzt werden.[18]

Literatur

Einzelnachweise

  1. The Nobel Prize in Chemistry 1993. Abgerufen am 24. November 2022 (amerikanisches Englisch).
  2. a b Patent US4683202A: Process for amplifying nucleic acid sequences. Angemeldet am 25. Oktober 1985, veröffentlicht am 28. Juli 1987, Anmelder: Cetus Corp, Erfinder: Kary B. Mullis.
  3. K. Kleppe et al.: Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNAs as catalyzed by DNA polymerases. In: J. Mol. Biol., 1971, Bd. 56, S. 341–361, PMID 4927950.
  4. Informationen der Nobelstiftung zur Preisverleihung 1993 an Kary B. Mullis (englisch).
  5. Eric S. Lander, Lauren M. Linton, Bruce Birren, Chad Nusbaum, Michael C. Zody: Initial sequencing and analysis of the human genome. In: Nature. Band 409, Nr. 6822, Februar 2001, ISSN 1476-4687, S. 860–921, doi:10.1038/35057062 (nature.com [abgerufen am 18. November 2020]).
  6. Debunking the 4 degree myth: PCR can be left at room temperature overnight – miniPCR. Abgerufen am 5. Juni 2018 (amerikanisches Englisch).
  7. Bernard J. Glick, Jack J. Pasternak, Cheryl L. Patten: Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. John Wiley & Sons, 4. Auflage 2010, ISBN 978-1-55581-498-4, S. 359ff.
  8. a b Thomas M. Devlin: Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations. John Wiley & Sons; 7. Auflage 2010, ISBN 978-0-470-28173-4, S. 269.
  9. JS. Chamberlain et al.: Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. In: Nucleic Acids Res. 16(23), 1988, S. 11141–11156, PMID 3205741, PMC 339001 (freier Volltext)
  10. Cornel Mülhardt: Der Experimentator: Molekularbiologie / Genomics. 6. Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, 2008, ISBN 978-3-8274-2036-7, S. 99.
  11. Ulrich Busch: Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik: Grundlegende Methoden und Anwendungen. Springer Verlag, Berlin 2010, ISBN 978-3-642-10715-3, S. 113.
  12. Journal of Clinical Microbiology Volume 51, Issue 3
  13. R Don, P Cox, B Wainwright, K Baker, J Mattick: Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. In: Nucleic Acids Res, 19(14);4008, PMID 1861999, PMC 328507 (freier Volltext)
  14. Hans-Joachim Müller, Daniel Ruben Prange: PCR - Polymerase-Kettenreaktion. Springer Berlin Heidelberg, Berlin, Heidelberg 2016, ISBN 978-3-662-48235-3, S. 140 ff., doi:10.1007/978-3-662-48236-0 (springer.com [abgerufen am 16. November 2020]).
  15. Carolina Scagnolari, Ombretta Turriziani, Katia Monteleone, Alessandra Pierangeli, Guido Antonelli: Consolidation of molecular testing in clinical virology. In: Expert Review of Anti-infective Therapy. Band 15, Nr. 4, 3. April 2017, ISSN 1478-7210, S. 387–400, doi:10.1080/14787210.2017.1271711 (tandfonline.com [abgerufen am 25. September 2020]).
  16. M. Fischer and I. Haase: PCR in der Lebensmittelanalytik, GIT Labor-Fachzeitschrift 3/06 (2006).
  17. F. Focke, I. Haase and M. Fischer: Trends in der Lebensmittelanalytik: DNA-basierte Wege zur Identifizierung von Gewürzen, Nachrichten aus der Chemie, 57, 1017–1020 (2009).
  18. I. Haase, M. Fischer: Differenzierung von Theobroma cacao und Theobroma grandiflorum mittels PCR. In: Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit. Band 2, Nr. 4, 1. November 2007, ISSN 1661-5751, S. 422–428, doi:10.1007/s00003-007-0252-1.