ADN helicase | |||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Identificadores | |||||||||
Número EC | 3.6.4.12 | ||||||||
Bases de datos | |||||||||
IntEnz | vista de IntEnz | ||||||||
BRENDA | entrada de BRENDA | ||||||||
ExPASy | vista de NiceZyme | ||||||||
KEGG | entrada de KEGG | ||||||||
MetaCyc | vía metabólica | ||||||||
PRIAM | perfil | ||||||||
Estruturas PDB | RCSB PDB PDBe PDBj PDBsum | ||||||||
|
ARN helicase | |||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Identificadores | |||||||||
Número EC | 3.6.4.13 | ||||||||
Bases de datos | |||||||||
IntEnz | vista de IntEnz | ||||||||
BRENDA | entrada de BRENDA | ||||||||
ExPASy | vista de NiceZyme | ||||||||
KEGG | entrada de KEGG | ||||||||
MetaCyc | vía metabólica | ||||||||
PRIAM | perfil | ||||||||
Estruturas PDB | RCSB PDB PDBe PDBj PDBsum | ||||||||
|
As helicases son unha clase de encimas vitais para todos os organismos vivos, xa que a súa principal función é desempaquetar os xenes dun organismo. Son proteínas motoras que se moven direccionalmente ao longo dunha molécula de ácido nucleico, separando as dúas febras apareadas do ácido nucleico (en ADNs, ARNs bicatenarios, ou en híbridos ARN-ADN) usando enerxía derivada da hidrólise do ATP. Existen moitas helicases debido á gran variedade de procesos nos cales se debe catalizar a separación de febras de ácidos nucleicos. Aproximadamente o 1% dos xenes eucariotas codifican helicases.[1] No xenoma humano están codificadas 95 helicases non redundantes, que son 64 ARN helicases e 31 ADN helicases.[2] Moitos procesos celulares, como a replicación do ADN, transcrición, tradución, recombinación, reparación do ADN, e bioxénese de ribosomas implican a separación de febras de ácido nucleico para o cal cómpre a intervención das helicases.
As helicases utilízanse con frecuencia para separar as febras do ADN de dobre hélice ou unha molécula de ARN autoapareada (self-annealed) utilizando a enerxía da hidrólise do ATP, un proceso no que se produce a rotura dos enlaces de hidróxeno entre os pares de bases apareados. Tamén funcionan retirando proteínas asociadas ao ácido nucleico e catalizan a recombinación homóloga do ADN.[3] Os procesos metabólicos nos que intervén o ARN, como a tradución, transcrición, bioxénese dos ribosomas, splicing do ARN, transporte do ARN, modificación ou edición do ARN, e degradación do ARN son todos facilitados polas helicases.[3] As helicases móvense ao longo dunha febra do dúplex do ácido nucleico cunha direccionalidade e procesividade específica para cada encima helicase determinado.
As helicases adoptan diferentes estruturas e estados de oligomerización. Aínda que as helicases de tipo DnaB desenrolan o ADN como hexámeros con forma de donut, outors encimas helicases son activos como monómeros ou dímeros. As helicases poden actuar pasivamente, agardando a que se produza un desenrolamento non catalizado e despois translocándose entre as febras desprazadas,[4] ou poden ter un papel activo catalizando a separación das febras usando a enerxía xerada pola hidrólise do ATP.[5] Neste último caso, a helicase actúa comparablemente a un motor activo, desenrolando as febras e translocándose ao longo do seu substrato como resultado directo da súa actividade de ATPase.[6] As helicases poden procesar moito máis rápido in vivo que in vitro debido á presenza de proteínas accfesorias que axudan na desestabilización da unión en forquita.[6]
A acción encimática das helicases, como o desenrolamento dos ácidos nucleicos realízase por medio da diminución da barreira de activación (B) de cada acción específica.[7] A barreira de activación é o resultado de varios factores, e pode definirse usando a seguinte ecuación, na cal N = número de pares de bases desenroladas (bps), ΔGbp = enerxía libre da formación de pares de bases, Gint = redución da enerxía libre debido á helicase, e Gƒ = redución da enerxía libre debido ás forzas de abertura da hélice.[7]
Os factores que contribúen a que a barreira de activación teña máis ou menos altura son: a secuencia específica do ácido nucleico implicado, o número de pares de bases implicadas, a tensión presente na forquita de replicación, e as forzas de desestabilización.[7]
O tamaño da barreira de activación que debe superar a helicase contribúe á súa clasificación como helicase activa ou pasiva. Nas helicases pasivas, hai unha barreira de activación significativa (definida como B > kBT, onde kB é a constante de Boltzmann e T é a temperatura do sistema).[7] Debido a esta barreira de activación significativa, a progresión de desenrolamento está afectada en gran medida pola secuencia do ácido nucleico que se ten que desenrolar, e a presenza de forzas de desestabilización que actúan sobre a forquita de replicación.[7] Certas combinacións na secuencia dos ácidos nucleicos fan diminuír as velocidades de desenrolamento (é dicir, tramos con guanina e citosina), mentres que varias forzas desestabilizantes poden incrementar a velocidade de desenrolamento.[7] En sistemas pasivos, a velocidade de desenrolamento (Vun) é menor que a velocidade de translocación (Vtrans) (translocación ao longo do ácido nucleico monocatenario, ssNA).[7] Outra forma de ver a acción dunha helicase pasiva é a súa dependencia do desenredamento transitorio dos pares de bases na forquita de replicación para determinar a súa velocidade de desenrolamento.[7]
Nas helicases activas, B < kBT, onde o sistema carece dunha barreira significativa, xa que a helicase pode desestabilizar o ácido nucleico, desenrolando a dobre hélice a unha velocidade constante, sen importar cal era a secuencia do ácido nucleico.[7] Nas helicases activas, Vun é aproximadamente igual a Vtrans.[7] Outra forma de considerar as helicases activas é a súa capacidade de desestabilizar directamente a forquita de replicación para promover o desenrolamento.[7]
As helicases activas mostran un comportamento similar cando actúan tanto sobre ácidos nucleicos bicatenarios (dsNA) coma monocatenarios (ssNA), con respecto ás velocidades de desenrolamento e velocidades de translocación, nos que en ambos os sistemas Vun e Vtrans son aproximadamente iguais.
As ADN helicases foron descbertas na bacteria Escherichia coli en 1976. Esta helicase foi descrita como “encima que desenrola o ADN” que “desnaturaliza a dobre hélice do ADN nunha reacción dependete do ATP, sen degradación detectable”.[8] A primeira ADN helicase eucariótica coñecida atopouse en 1978 nas plantas liliáceas (Lilium).[9] Desde entón, descubríronse e illáronse ADN ligases en diversas bacterias, virus, lévedos, moscas e eucariotas superiores.[10] Ata agora foron illadas 14 helicases diferentes de organismos unicelulares, 6 helicases de bacteriófagos, 12 doutros virus, 15 de lévedos, 8 de plantas, 11 do timo de tenreiras, e aproximadamente 25 helicases de células humanas.[11] Segue unha historia do descubrimento das helicases:
A función común das helicases explica que teñan un certo grao de homoloxía de secuencia de aminoácidos; todas posúen un motivo de secuencia localizado na súa estrutura primaria, implicado na unión ao ATP, na hidrólise do ATP e na translocación ao longo do seu substrato o ácido nucleico. A porción variable da secuencia de aminoácidos está relacionada coas características específicas de cada helicase.
A presenza destes motivos de helicase permite que a unha determinada proteína se lle poida atribuír unha suposta actividade de helicase, pero non necesariamente confirma dita actividade. Os motivos conservados apoian unha homoloxía evolutiva entre os encimas. Baseánsode nestes motivos de helicase, distinguíronse varias superfamilias.
As helicases clasifícanse en 6 grupos (superfamilias) baseándose nos motivos de secuencia que comparten.[21] As helicases que non forman unha estrutura en anel clasifícanse nas superfamilias 1 e 2 e as que forman o anel forman parte das superfamilias 3 a 6.[22] As helicases tamén se clasifican como α ou β dependendo de se funcionan con ADN monocatenario (α helicases) ou bicatenario (β helicases). Tamén se clasifican pola súa polaridade de translocación, de tal maneira que se a trnalocación ocorre en dirección 3’-5’ a helicase considérase de tipo A, e se esta ocorre en dirección 5’-3’ é de tipo B.[21]
O xene ATRX codifica a helicase dependente do ATP ATRX (tamén chamada XH2 e XNP) da familia do subgrupo SNF2, que se cre é responsable de funci´ñons como a remodelación d cromatina, regulación xénica, e metilación do ADN.[27][28][29][30] Estas funcións axudan a previr a apoptose, que regula o tamaño do córtex cerebral, e contribúe á supervivencia de estruturas do hipocampo e corticais, que afectan á memoria e aprendizaxe.[27] Esta helicase está localizada no cromosoma X (Xq13.1-q21.1), na heterocromatina pericentromérica e únese á proteína heterocromatínica 1 (HP1).[27][29] Studies have shown that ATRX plays a role in rDNA methylation and is essential for embyonic development.[31] Atropáronse mutacións na proteína ATRX, e o 90% delas están asociadas con dominios dedo de cinc e helicase.[32] As mutacións da ATRX poden causar atraso mental con alfa-talasemia ligada ao X (síndrome ATR-X).[27]
Varios tipos de mutacións da ATRX están asociados á síndrome ATR-X, incluíndo máis frecuentemente mutacións sen sentido dunha soa base, e mutacións sen sentido por corremento da pauta e delecións.[30] As características da síndrome ATR-X inclúen: microcefalia, anormalidades faciais e esqueléticas, atraso mental, anormalidades xenitais, epilepsia, uso e habilidade lingüística limitada, e alfa-talasemia.[27][31][33] O fenotipo da síndrome ATR-X suxire que a mutación do xene ATRX causa a regulación á baixa da expresión xénica, como por exemplo nos xenes da alfa-globina.[33] Aínda non se sabe que causa a expresión das variadas características da síndrome ATR-X en diferentes pacientes.[31]
A XPD (factor D de xeroderma pigmentoso, tamén chamada proteína ERCC2) é unha helicase dependente de ATP de tipo 5'-3' da superfamilia II, que contén dominios con grupos de ferro-xofre.[34][35] As mutacións puntuais herdadas na helicase XPD están asociadas con trastornos de envellecemento acelerado como a síndrome de Cockayne (CS) e a tricotiodistrofia (TTD).[36] A síndrome de Cockayne e a tricotiodistrofia son ambas trastornos de desenvolvemento que implican a sensibilidade á luz ultravioleta e o envellecemento prematuro, e a síndrome de Cockayne preséntase con atraso mental grave desde o momento do nacemento.[36] A mutación da helicase XPD foi tamén implicada no xeroderma pigmentoso (XP), un trastorno caracterizado pola sensibilidade á luz ultravioleta, que multiplica por 1000 a posibilidade de desenvolver cancro de pel.[36]
A helicse XPD é un compoñente esencial do complexo TFIIH, que é un factor de transcrición e reparación da célula.[36][37][38][39][40] Como membro deste complexo, facilita a reparación de excisión de nucleótido ao desenrolar o ADN.[36] O TFIIH axuda a reparar o ADN danado como por exemplo os danos producidos polo sol.[36][37][38][39][40] Unha mutación na helicase XPD que axuda a formar este complexo e contribúe ao seu funcionamento causa a sensibilidade á luz solar que se observa nestas tres doenzas, e o incremento de cancro no xeroderma pigmentoso e no envellecemento prematuro característico da tricotiodistrofia e a síndrome de Cockayne.[36]
As mutacións na helicase XPD que causan a tricotiodistrofia encóntranse por toda a proteína en varias localizacións implicadas en interaccións proteína-proteína.[36] Estas mutacións dan lugar a unha proteína inestable debido a que terá unha incapacidade de formar reaccións estabilizantes con outras proteínas nos puntos de mutación.[36] Isto, á súa vez, desestabiliza todo o complexo TFIIH, o que orixina defectos nos mecanismos de transcrición e reparación da célula.[36]
Propúxose que as mutacións na helicase XPD que orixinan a síndrome de Cockayne poderían ser o resultado de mutacións dentro da XPD que causan rixidez da proteína e incapacidade de cambiar de facer funcións de reparación a facer funcións de transcrición debido a quedar "bloqueada" no modo de reparación.[36] Isto podería causar que a helicase cortase o segmentos de ADN necesarios para a transcrición.[36] Aínda que as probas dispoñibles actualemnte apuntan a que hai un defecto na helicase XPD que resulta na perda de flexibilidade na proteína en casos de síndrome de Cockayne, aínda non está claro como esta estrutura proteica orixina os síntomas descritos en dita síndrome.[36]
No xeroderma pigmentoso, a mutación na helicase XPD prodúcese no sitio de unión ao ATP ou ao ADN.[36] Isto ten como resultado unha helicase estruturalmente funcional que pode facilitar a transcrición, pero inhibe a súa función de desenrolar o ADN e a reparación do ADN.[36] A falta de capacidade da célula de reparar as mutacións, como as causadas polo sol, crese que é a causa da alta taxa de cancro de pel en pacientes de xeroderma pigmentoso.
As helicases RecQ (3'-5') pertencen á superfamilia II de helicases, e axudan a manter a estabilinade do xenoma e suprimen a recombinación inapropiada.[41][42] As deficiencias ou mutacións na familia das helicases RecQ producen unha recombinación xenética e replicación do ADN anormais, o que leva a unha inestabilidade cromosómica e a un descenso global da capacidade da célula de proliferar.[41] As mutacións nas helicases desta familia chamadas BLM, RECQL4 e WRN, que xogan un papel na regulación da recombinación homóloga, orixinan as doenzas conxénitas autosómicas recesivas síndrome de Bloom, síndrome de Rothmund-Thomson, e síndrome de Werner, respectivamente.[42][43]
A síndrome de Bloom caracterízase por unha predisposición ao cancro de aparición temperán, a unha idade media de inicio de 24 anos.[42][44] As células dos pacientes de síndrome de Bloom presentan unha alta frecuencia de intercambio recíproco entre cromátides irmás e un dano cromosómico excesivo.[45] Hai probas que suxiren que a BLM xoga un papel en recuperar a replicación do ADN interrompida en forquitas de replicación.[45]
A síndrome de Werner é un trastorno de envellecemento prematuro con síntomas que inclúen un comezo temperán de arterosclerose e osteoporosre e outras doenzas relacionadas coa iade, unha alta frecuencia de sarcoma, e de morte a miúdo causada por infarto de miocardio ou cancro entre os 40 e 60 anos.[42][46] As células dos pacientes de síndrome de Werner mostran unha duranción da súa etapa reprodutiva reducida con roturas cromosómicas e translocacións, e grandes delecións de compoñentes cromosómicos, causando inestabilidade xenómica.[46]
A síndrome de Rothmund-Thomson, tamén chamada poiquiloderma conxénito, caracterízase por un envellecemento prematuro, anormalidades na pel e esqueleto, erupcións cutáneas, poiquiloderma, cataratas xuvenís, e unha predisposición aos cancros como os osteosarcomas.[42][47] Nas células de pacientes desta síndrome atópanse rearranxos cromosómicos que causan inestabilidade xenómica.[47]
As ARN helicases son esenciais para a maioría dos procesos do metaboiismo do ARN como a bioxénese de ribosomas, o splicing do ARNm e a iniciación da tradución. Tamén desempeñan un importante papel na detección dos ARNs virais.[48] As ARN helicases están implicadas na madiación da resposta inmune antiviral porque poden identificar o ARN alleo en vertebrados. Aproximadamente o 80% dos virus son virus de ARN e conteñen as súas propias ARN helicases.[49] As ARN helicases defectuosas foron asociadas con cancros, doenzas infecciosas e trastornos neurodexenerativos.[48] Algúns trastornos neurolóxicos asociados con ARN helicases defectuosas son: esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular espiñal, ataxia espiñocerebelar de tipo 2, enfermidade de Alzheimer, e síndrome de contractura conxénita letal.[49]
As ARN helicases e ADN helicases poden encontrarse xuntas en todas as superfamilias de helicases agás en SF6.[50][51] Todas as ARN helicases eucariotas que foron identificadas ata agora non forman anel e son de tipo SF1 ou SF2. Por outra parte, as ARN helicases que forman anel encontráronse en bacterias e virus.[48] Porén, non todas as ARN helicases mostran actividade de helicase definida pola súa función encimática, como as proteínas da familia Swi/Snf.[52] Aínda que estas proteínas levan os motivos típicos das helicases, hidrolizan ATP de maneira dependente de ácido nucleico, e están construídas arredor dun núcleo de helicase, en xeral, non se observa nelas ningunha actividade de desenrolamento de ácidos nucleicos.[53]
As ARN helicases que mostran unha actividade de desenrolamento foron caracterizadas por polo menos dous mecanismos diferentes: desenrolamento do dúplex canónico e separación de febras local. O desenrolamento de dúplex canónico é a separación direccional gradual dunha febra dúplex, como se describiu máis arriba, para o desenrolamento do ADN. Porén, a separación de febras local ocorre por un proceso no que o encima helicase cárgase en calquera punto ao longo do dúplex. A isto axuda unha rexión monocatenaria do ARN, e a carga do encima está acompañada da unión de ATP.[54] Unha vez que están unidos as helicases e o ATP, ocorre a separación de febras local, o cal require a unión do ATP pero non a hidrólise de dito ATP.[55] O dúplex ten poucos pares de bases e disóciase despois sen necesitar máis asistencia do encima. Este modo de desenrolamento é o utilizado polas helicases de caixa DEAD.[56]
Hai unha base de datos de ARN helicases dispoñible on line que contén unha lista de ARN helicases con información da súa secuencia, estrutura, e funcións bioquímicas e celulares.[48]
Utilízanse varios métodos para medir a actividade de helicase in vitro. Estes métodos poden ser ensaios ou probas cualitativos ou cuantitativos. En 1982-1983, desenvolveuse o primeiro ensaio bioquímico directo para medir a actividade de helicase.[10][57] Este método denomínase “ensaio de desprazamento de febra”.
Outros métodos que se desenvolveron máis tarde incorporaron características como: mecánica de alto rendemento, o uso do etiquetado de nucleótidos (menos perigoso), tempo de reacción máis rápido/menos consumo de tempo, monitorización en tempo real da actividade de helicases (usando medicións cinéticas en troques de análises de punto final/de punto único). Entre estas metodoloxías están: "un método de fluxo de arrefriado rápido, ensaios baseados en fluorescencia, ensaios de filtración, un ensaio de proximidade de escintileo, ensaio de transferencia de enerxía de resonancia fluorescente resolta no tempo, un ensaio baseado na tecnoloxia flashplate, ensaios de arrefriamento resolto no tempo homoxéneos, e ensaios de helicase baseados en electroquimioluminescencia".[11] Co uso de ecuacións matemáticas especializadas, poden utilizarse algúns destes ensaios para determinar que cantidade de nucleótidos apareados pode separar a helicase por hidrólise de 1 molécula de ATP.[58]
Hai kits de diagnóstico dispoñibles comercialmente. Un deles é o ensaio de diagnóstico "Trupoint" de PerkinElmer, Inc. Este ensaio é un ensaio de arrefriamento (quenching) de fluorescencia resolto no tempo que utiliza a tecnoloxía PerkinEmer "SignalClimb" que está baseada en dúas etiquetas que se unen en estreita proximidade pero en febras do ADN opostas.
A polaridade da helicase, que tamén se denomina "direccionalidade", defínese como a dirección (que pode ser 5'→3' ou 3'→5') do movemento da helicase sobre un ADN monocatenario. Esta determinación da polaridade é vital para determinar se a helicase probada se une á febra líder do ADN ou á febra atrasada. Para caracterizar esta característrica da helicase, utilízase un dúplex parcial de ADN como substrato que ten unha rexión de ADN monocatenario con diferentes lonxitudes de rexións dúplex de ADN (unha rexión curta que corre en dirección 5'→3' e unha máis longa que corre en 3'→5') a ambos os lados da rexión.[59] Unha vez que se engade a helicase a esa rexión monocatenaria central, determínase a polaridade por caracterización no ADN monocatenario de nova formación.
![]() |
Commons ten máis contidos multimedia sobre: Helicase |